ELISA的操縱因固相載體的形成不同而有所差異，海內醫學檢修一般均用板式點。除特殊情況外，在醫學檢修中均以血清作為檢測標本。加酶結合物應用液和底物用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應。每次加標本應更換吸嘴，以發生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。的試劑，良好的儀器和準確的操縱是保證ELISA試劑盒檢測結果正確可靠的必要條件。ELISA頂用的蒸餾 水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的。有些標本可直接進行測定(如血清 、尿液)，有些則需經預處理(如糞便和某些分泌物)。

    在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下倒置混和，不要在混勻器上強烈振蕩。制備血漿標本需借助于抗凝劑，而血清標本只要待血清天然凝固、血塊收縮后即可取得。也可在板孔中加入稀釋液，再在其加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。一般說來，在5天內測定的血清標本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。可用作ELISA測定的標本十分廣泛，體液(如血清 )、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、糞便)等均可作標本以測定其中某種抗體 或抗原成份，ELISA試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保留。